Цитокинины

Автор Чергинцев Д. А.

Культуры клеток являются неотъемлемой частью разнообразных лабораторных исследований. Выращивание стерильных культур клеток животных началось около 100 лет назад, однако клетки растений довольно долгое время никак не поддавались содержанию на питательных средах в лабораториях. Были выделены многие метаболиты растений, частично исследованы механизмы роста, в среду для культивирования добавляли ауксины... Не помогали и разнообразные экстракты дрожжей и растений, а также выделенная из молок сельди ДНК. Клетки в культуре лишь вяло делились и чаще всего скоро прекращали развитие. Однако в ходе наблюдений выяснилось, что кокосовое молоко и флоэмные экссудаты могут стимулировать деление клеток. Таким образом, было очевидно, что существует некое вещество, ответственное за пролиферацию клеток.

Ни для кого не секрет, что многие открытия происходят по чистой случайности или даже из-за неосторожности и несоблюдения методики. Так получилось и в этом случае. Перед посадкой культуры помещенную в автоклав среду перегрели, и внезапно именно на этой среде культура стала нормально расти, а клетки - делиться. Было выделено вещество, индуцирующее деление: им оказался 6-фурфуриладенин, названный кинетином (от слова «деление»). Как выяснилось, при нагревании и разрушении ДНК часть аденинов отсоединяется от сахарного остатка и претерпевает пренилирование по шестому положению. Действующее вещество было выделено Миллером в 1955 году. Таким образом, кинетин – это искусственный цитокинин, являющийся, в отличие от природных аналогов, термостабильным.

Первый природный цитокинин – зеатин - вскоре был выделен из эндосперма кукурузы (Zеа) в 1961 году.

Важнейшие из цитокининов, которые встречаются в растениях в свободном виде – N6-изопентениладенин (IPA) и транс-зеатин (tZ) (рис.1).

Природные цитокинины также являются производными аденина. В ходе синтеза к азотистому основанию рибонуклеотида (АМФ) цитокинин-синтаза (изопентенилтрансфераза) присоединяет изопентенильную группу в 6-ом положении, а далее происходит дефосфорилирование с последующем отщеплением рибозы (рис.2).

Интересно, что цис-зеатин и изопентениладенин могут входить в состав тРНК, но, по-видимому, «образования» гормона при ее распаде не происходит.

Цитокинины в клетке могут быть инактивированы путем коньюгации с сахарами или путем окисления с удалением пренилового остатка.

Биосинтез цитокининов происходит в основном в апикальной меристеме корня, но также может протекать в листьях, семенах, плодах и элементах флоэмы. Концентрация гормона в основном убывает по мере удаления от места синтеза.

Рецепторы цитокининов (например, белок CRE 1) расположены на клеточной мембране, причем наружный фрагмент связывается с цитокинином, а внутренний, находящийся в цитозоле, обладает киназной активностью (типичные димерные гистидинкиназы). Связывание гормона индуцирует фосфорилирование рецептора по остатку гистидина. Предполагается, что рецептор взаимодействует с МАР-киназной системой (mitogen-activated protein). МАР-киназные пути в клетках приводят к изменению программы развития, активируя разнообразные факторы транскрипции, то есть влияя на реализацию генетической информации и клеточный цикл. Многие механизмы этих путей остаются плохо изученными.

В отличие от ауксинов, для цитокининов не существует полярного транспорта: они переносятся пассивно и  неполярно по растению снизу вверх по ксилеме (рис.4).

Как и ауксины, цитокинины вызывают множество физиологических эффектов.

1. Аттрагируюций эффект. Как и апекс побега, апекс корня нуждается в питательных веществах.

Если провести эксперимент (рис.5), в ходе которого на отделенные от растения листья будут наносить питательные вещества (меченный глицин ¹⁴С) и цитокинин (кинетин), то можно выявить ряд показательных закономерностей.

Возьмем три двухлисточковые части сложного листа. В первом случае нанесем глицин только на один из двух листочков; во втором на один глицин, на второй - кинетин; в третьем случае - и глицин и кинетин, но только на одну листовую пластинку.

По окраске листьев (на картинке, на самом деле – по распределению радиоактивной метки) можно судить о перераспределении питательных веществ. В первом случае более интенсивно окрашенной будет листовая пластинка, обработанная глицином; во втором наблюдается перетекание веществ из листочка, обработанного глицином,  в обработанный кинетином; в третьем – окрашена только область вокруг точки внесения веществ.

Данный опыт наглядно демонстрирует аттрагирующие свойства гормона.

Цитокинины можно назвать гормонами «молодости» растений (в противоположность этилену). Действительно, с помощью привлечения питательных веществ в определенный орган растения можно замедлить и остановить старение этого органа. Такой эффект можно наблюдать, обрабатывая цитокининами листья деревьев по осени: обработанная листва останется зеленой и не будет опадать.

Этим же объясняется и монокарпия некоторых растений (цветут один раз в жизни). Помимо двулетних, существуют также растения, которые растут не один десяток лет, чтоб потом один раз зацвести и умереть (бамбук, агава). Возможно, при цветении генеративные структуры настолько сильно обедняют цитокининами растение, что оно умирает «от истощения».

2. Дифференцировка клеток. Цитокинины в основном функционируют в зоне деления корня и, транспортируясь вверх с ксилемным током, накапливаются в апикальной меристеме. При этом происходит контакт цитокининов с камбием, что вызывает пролиферацию его клеток.
3. Развитие хлоропластов
4. Снятие апикального доминирования. Нормально функционирующая корневая система должна быть хорошо обеспечена продуктами ассимиляции, что также позволяет нарастить вегетативную массу. Сигналы от корня к побегу, вызывающие рост его частей (в том числе и почек), передаются с помощью цитокининов.
5. Открытие устьиц происходит в случае поступления из корня богатой цитокининами воды, а их закрытие - если полученные растворы бедны этим гормоном (и обогащены абсцизовой кислотой).
6. Подавление роста боковых корней. Действительно, если цитокинина много, то главный корень хорошо функционирует, поэтому в образовании боковых корней необходимости нет.
7. Стимуляция роста бессемянных плодов (партенокарпия). Она тоже связана с аттрагирующим эффектом цитокининов.

Взаимодействие цитокининов и ауксинов

Таким образом, ауксины можно назвать гормонами благополучия побега, влияющими на растяжение клеток, а цитокинины – гормонами благополучия корня, вызывающими пролиферацию клеток. Развитие растения очень сильно зависит не просто от концентраций этих двух гормонов, но от баланса между ними. На примере культуры in vitro (рис.6) можно наблюдать активный ризогенез при смещении равновесия в пользу ауксина, и образование побеговой системы - в случае преобладания цитокинина. Если нет ни одного из гормонов, то деления не происходит, а если в избытке оба, то видно нарастание каллусной массы. Обнаружено, что ауксины активируют циклин-зависимые киназы (CDK), а цитокинины – соответствующие циклины. Комплекс CDK-циклин необходим для клеточного деления.

Взаимодействие гормонов можно наглядно продемонстрировать и на примере целого растения, например, при черенковании. Отделенная веточка представляет собой нормально развитый побег, и, соответственно, там идет синтез ауксина. А вот корней нет, и поэтому там наблюдается явная нехватка цитокининов. Благодаря полярному транспорту ауксины идут по побегу вниз, накапливаются у основания и вызывают ризогенез. Наоборот, если взять корень, богатый цитокининами, у его верхушки происходит накопление гормона, вызывающее пробуждение спящих почек  или образование каллусной массы и геммагенез.

Обратите внимание на положение камбия: он находится между ксилемой, транспортирующей вверх цитокинины, и флоэмой, по которой вниз идут ауксины. Таким образом, камбий получает одновременно оба гормона. При избытке цитокинина происходит преимущественная закладка флоэмы, при избытке ауксинов – ксилемы.

К биосинтезу цитокининов также способны представители бактерий, грибов, насекомых и нематод. Такие особенности были сформированы в ходе длительной коэволюции этих организмов и растений. Так, например, личинки бабочки Stigmella вырабатывают цитокинины, чтобы предотвратить увядание пораженных листьев, которые в итоге остаются зелеными даже во время осеннего листопада.

Фитопатогенные грибы, вырабатывающие цитокинин, стимулируют разрастание растительных тканей, что ведет к образованию так называемых «ведьминых метел» - структур, которые образуются в результате аномально частого ветвления веток деревьев.

Многие бактерии, способные к синтезу цитокининов и ауксинов, вызывают опухоли растений. Примером служит знаменитая Agrobacterium tumefaciens - агробактерия корончатых галлов у растений, которая является одним из основных инструментов в биотехнологии благодаря своей способности трансформировать геном растения участками собственных плазмид.